Tercer juego principal de la franquicia Assassin's Creed. Lanzado a USA el 16 de noviembre del 2010 y el 20 de noviembre del mismo año para el resto del mundo.Después de escapar del ataque de los Templarios al final de Assassin's Creed II. Desmond Miles, Lucy Stillman,Rebecca Crane y Shaun Hastings huyen a Monteriggioni, estableciendo un nuevo escondite en las ruinas de la Villa Auditore. Después de restaurar la electricidad en los viejos túneles bajo la villa, el jugador una vez más toma el control de Ezio Auditore a través de la memoria genética de Desmond Miles usando el Animus 2.0. Su misión es encontrar el Fruto del Edén, un artefacto importante y misterioso que podría impedir el desastre inminente que está llegando en ese mismo año, que se cree fue perpetrado por los Templarios.

Assassin's Creed: Brotherhood es un videojuego de acción-aventura en tercera persona cuyo énfasis principal es el sistema de juego al estilo "sandbox" en un mundo abierto en la antigua ciudad de Roma. Como en los títulos anteriores, la mecánica principal del juego está basada en movimientos de parkour, sigilo, agilidad, estrategia, luchas, esgrima, escondites (fardos de heno, hojas, bancos, mezclarse con la multitud), asesinatos y un sistema de pelea cuerpo a cuerpo. El sistema de combate presenta múltiples mejoras y por primera vez en la serie, el juego ofrece un modo multijugador junto con más de 15 horas de modo de un solo jugador.

El juego introduce un nuevo sistema de gestión: el jugador puede reclutar nuevos miembros destruyendo las 15 "torres Borgia" en Roma, donde las tropas papales se encuentran estacionadas, y luego rescatando ciudadanos descontentos por el acoso de los guardias. El jugador, como Ezio, puede enviarlos a múltiples tareas por toda Europa o llamarlos como apoyo durante misiones (si no están ocupados antes). Colocar tareas a los nuevos asesinos los hace ganar puntos de experiencia, y el jugador puede personalizar su apariencia, habilidades y entrenamiento con armas hasta cierto grado, consumiendo los puntos de habilidad que ellos han ganado. Los asesinos pueden morir en misiones, de las cuales no regresarán. Ezio domina nuevos dispositivos como el paracaídas de Leonardo da Vinci, el cual puede ser usado para saltar de edificaciones altas, junto a los dardos venenosos, un veneno de más rápida acción, una ballesta y la habilidad para blandir y lanzar armas más pesadas como hachas. Además de muchas misiones especiales como: Máquinas de Leonardo, Encargos de Cortesana, de Bandidos, de Mercenarios, etc.